酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

　　

　　HRP標記抗體稀釋液(HRP-AntibodyDilutionBuffer)適用于免疫組織化學與免疫印跡等實驗中HRP標記抗體的稀釋。稀釋液中添加了抗體保護劑和穩(wěn)定劑等成分，有效增加了稀釋后HRP標記抗體的穩(wěn)定性。用此稀釋液稀釋后的HRP標記抗體可在2-8℃穩(wěn)定保存至少六個月。

　　

　　注意事項：

　　

　　如需抗體回收再利用，建議在2-8℃進行抗體的結(jié)合反應，以減緩抗體效價的衰減速度。

　　

　　為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

　　

　　HRP標記抗體工作濃度的選擇：

　　

　　在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

　　

　　1.酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。

　　

　　2.其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05MPH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2MH２SO40.05ml終止反應。

　　

　　3.結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以OD為縱座標，結(jié)合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。